As hialuronano sintases (HAS) são enzimas ligadas à membrana que utilizam UDP-α-N-acetil-D-glicosamina e UDP-α-D-glicuronato como substratos para produzir o glicosaminoglicano hialurônico na superfície celular e secretá-lo através da membrana para o espaço extracelular.
Isoformas Até o momento, foram descritas três hialuronano sintases mamíferas: HAS1 [en], HAS2 [en] e HAS3 [en]. Cada uma dessas isoformas está localizada em um cromossomo diferente e já foi clonada. Duas das principais diferenças entre as isoformas são o comprimento das cadeias de hialuronano que produzem e a facilidade com que essas moléculas são liberadas da superfície celular. Quando células mamíferas são estimuladas por mudanças em seu ambiente imediato (citocinas, proximidade da matriz extracelular), as isoformas HAS respondem de maneira distinta e parecem estar sob diferentes mecanismos de controle. Durante o desenvolvimento do embrião, cada isoforma é expressa de forma única, tanto espacial quanto temporalmente:
HAS2 provavelmente é a sintase mais importante nesse período, pois camundongos sem a capacidade de expressar HAS2 (camundongos knockout) morrem no meio da gestação, Camundongos knockout para HAS1 ou HAS3 não apresentam efeito no desenvolvimento fetal. As isoformas de HAS também apresentam efeitos fisiológicos e potenciais terapêuticos variados. A HAS2 está superexpressa em linhagens celulares de câncer de mama e está associada à metástase em linfonodos, enquanto HAS1 e HAS3 não apresentam correlações com o desenvolvimento ou metástase do câncer. A HAS2 também foi proposta como agente nanoterapêutico para combater artrose em articulações que apresentam inflamação sinovial devido ao aumento da despolimerização do hialuronano. Em contraste, a estimulação da HAS3 foi associada ao aumento da inflamação e aterosclerose por meio da liberação aumentada de interleucina e ativação de macrófagos.
Estrutura A HAS1 possui um único domínio proteico catalítico e está embutida no canal transmembranar para formar ligações glicosídicas na produção de hialuronano (HA). Contém cinco hélices transmembranares e três hélices de interface, cuja arquitetura geral lembra uma tenda. A isoforma da bactéria Pasteurella multocida (pmHAS) contém 972 resíduos, nos quais a deleção dos resíduos 1-117 não afeta a atividade enzimática, e o carboxilo terminal do sítio ativo reside ao redor dos resíduos 686-703. Dois resíduos catalíticos existem no domínio catalítico: uma mutação de ácido aspártico para asparagina na posição 196 (D196N) leva à perda da atividade de GlcUA-transferase, e uma mutação de ácido aspártico para lisina na posição 477 (D477K) leva à perda da atividade de GlcNAc-transferase. A combinação de ambas as mutações resulta em atividade semelhante à do tipo selvagem. A pmHAS contém ainda uma sequência Asp-Gly-Ser conservada entre as beta-glicosiltransferases. A HAS2 é regulada por dimerização [en] e ubiquitinação. Em células renais de macaco COS-1 transfectadas com plasmídeos de HAS2 e HAS3 de camundongos, observou-se um sítio de ubiquitinação na lisina no resíduo 190. Um mutante K190R formou um dímero de HAS2, e HAS2 e HAS3 marcados mostraram formação de homodímeros e heterodímeros entre si. A HAS do vírus Chlorella (Cv-HAS) apresenta aproximadamente 45% de similaridade de sequência com a HAS2 humana. A HAS3 é regulada por truncamento da extremidade 3'UTR, que reduz a expressão de NUDT21 [en], um regulador da poliadenilação. A perda desse sítio regulador em modelos roedores promove processos neoplásicos, fenótipos pró-remodelação aumentados e elevação da síntese de HA, mas também aumenta a probabilidade de hipertensão pulmonar. A HAS3 apresenta maior identidade de sequência com a HAS2 (71%) do que com a HAS1 (57%). HAS1, HAS2 e HAS3 possuem treze, quatorze e quatorze resíduos de cisteína, respectivamente, em comparação com a HAS de S. pyogenes (spHAS), que contém seis resíduos de cisteína. Uma cisteína sulfidrílica envenenada na posição 225 na spHAS inibe a atividade enzimática, mas não está claro se as ligações dissulfeto exercem efeito significativo na atividade das enzimas HAS. Os gráficos de hidropatia entre as três isoformas HAS1, HAS2 e HAS3 sugerem que cada proteína está organizada de maneira semelhante na membrana.
Mecanismo A iniciação da biossíntese de hialuronano pelas hialuronano sintases de Classe I envolve a geração in situ de N-acetilglicosamina (GlcNAc) por meio da hidrólise de UDP-GlcNAc, seguida pela difusão de N-acetilglicosamina para o sítio ativo. O sítio ativo contém dois domínios distintos, cada um capaz de se ligar à cadeia UDP-hialuronano nascente ou a um monômero UDP-açúcar. O alongamento da cadeia, iniciando-se a partir de GlcNAc, ocorre com a adição sequencial de unidades alternadas de UDP-GlcA e UDP-GlcNAc na extremidade redutora da cadeia em crescimento.
Em cada iteração de alongamento da cadeia, um domínio do sítio ativo é ocupado pela cadeia UDP-hialuronano existente. Um monômero UDP-açúcar correspondente à próxima unidade então se liga ao domínio do sítio ativo desocupado. Em seguida, um grupo hidroxila no monômero UDP-açúcar ligado realiza um ataque nucleofílico no carbono anômero do monômero redutor da cadeia UDP-hialuronano, deslocando o UDP da cadeia de hialuronano e transferindo a cadeia alongada para o domínio previamente ocupado pelo UDP-açúcar. Após esse processo, o UDP deslocado se dissocia do outro domínio do sítio ativo. O processo de ligação do monômero e alongamento então se repete, com unidades alternadas de GlcA e GlcNAc sendo adicionadas enquanto a cadeia UDP-hialuronano alterna de um domínio do sítio ativo para o outro. HAS1, HAS2 e HAS3 realizam biossínteses funcionalmente equivalentes de hialuronano, mas demonstram diferenças nas características cinéticas, incluindo a HAS1 apresentando uma constante de Michaelis maior que HAS2 ou HAS3. A cinética das HAS e o endereçamento de proteína também são influenciados por modificações pós-traducionais e epigenéticas.
Papel na metástase do câncer As HAS podem desempenhar papéis em todas as etapas da metástase do câncer. Ao produzir HA antiadesivo, as HAS permitem que células tumorais se liberem da massa tumoral primária; se o HA se associar a receptores como CD44, a ativação de Rho GTPases pode promover a EMT das células cancerígenas. Durante os processos de intravasação ou extravasação, a interação do HA produzido pelas HAS com receptores como CD44 ou RHAMM promove as alterações celulares que permitem a infiltração das células cancerígenas nos sistemas vascular ou linfático. Enquanto viajam nesses sistemas, o HA produzido pelas HAS protege a célula cancerígena de danos físicos. Finalmente, na formação de uma lesão metastática, as HAS produzem HA para permitir que a célula cancerígena interaja com células nativas no local secundário e forme um tumor para si mesma. O aumento da produção de HA por células cancerígenas eleva a capacidade invasiva. A interação do HA com CD44 ativa a quinase de adesão focal (FAK), molécula importante no processo de motilidade celular ao coordenar a dissolução das adesões focais na borda anterior da célula e sua formação na borda posterior. Outra via de sinalização ativada pela interação do HA com CD44 é a via Akt, que leva à expressão de osteopontina, molécula que pode estimular a migração celular. O HA produzido pelas HAS também foi sugerido como protetor da célula cancerígena contra danos físicos durante a circulação nos sistemas circulatório ou linfático. Esse papel do HA foi demonstrado em outros tipos celulares, mas ainda não foi pesquisado em células cancerígenas. O HA produzido pelas HAS também aumenta a secreção de várias MMPs, enzimas proteolíticas envolvidas em várias etapas da cascata metastática. Pesquisas indicam que as diferentes HAS podem impactar as etapas metastáticas de maneiras distintas com base no peso molecular e na quantidade de HA que produzem.
Referências
Ligações externas EC 2.4.1.212 MeSH hyaluronan+synthase